熒光-PCR法是利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程，后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。PCR反應過(guò)程中產(chǎn)生的DNA拷貝數是呈指數方式增加的，隨著(zhù)反應循環(huán)數的增加，最終PCR反應不再以指數方式生成模板，從而進(jìn)入平臺期。將已知濃度的標準品梯度稀釋進(jìn)行PCR，按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴增曲線(xiàn)。Ct值與起始模板數的對數值之間存在線(xiàn)性關(guān)系，可以制作標準曲線(xiàn)。未知濃度的樣品也得到Ct值，代入標準曲線(xiàn)，就可以求出未知樣品的起始模板量。
熒光-PCR法實(shí)驗成功的因素離不開(kāi)優(yōu)良試劑的選擇：
1.標準曲線(xiàn)的質(zhì)量直接影響定量的準確性。建議使用標準品專(zhuān)用稀釋Buffer稀釋標準品。
2.根據采用的熒光檢測方法進(jìn)行試劑選擇。選擇探針?lè )▽?zhuān)用試劑。
3.RT-PCR要根據實(shí)驗目的進(jìn)行試劑選擇。mRNA表達量分析選擇兩步RT-PCR試劑，病毒病原菌檢測選擇一步RT-PCR試劑。
4.PCR反應通常樣品數量較多，操作步驟過(guò)多易產(chǎn)生錯誤。選擇PCR反應用Buffer、DNA聚合酶、dNTP等試劑已經(jīng)預混在一起的試劑，操作更加簡(jiǎn)單方便。同時(shí)，使用的試劑最好不需要進(jìn)行Mg2＋濃度的優(yōu)化等實(shí)驗。
5.PCR反應對反應特異性要求高。最好選擇應用DNA聚合酶的試劑。但有一點(diǎn)需要強調，DNA聚合酶有兩種類(lèi)型，即化學(xué)修飾型和抗體結合型。使用這兩種DNA聚合酶的PCR反應條件不同，使用化學(xué)修飾型DNA聚合酶，需要在PCR條件的起初步驟設置10-15分鐘的熱變性程序，以恢復DNA聚合酶的活性；而抗體結合型DNA聚合酶，不需長(cháng)時(shí)間的熱變性步驟，通常的PCR條件即可恢復DNA聚合酶的活性，適合快速PCR反應。
6.所選試劑要與使用的RT-PCR檢測系統相匹配。最好選擇對各種機型裝置都顯示良好反應性能的試劑。
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更新時(shí)間：2021-05-12
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